Mucha más independencia denota lo que ocurría en Sevilla desde los comienzos del siglo.
La ciudad de Sevilla alcanzaba entonces gran importancia gracias al tráfico con América. Pronto allí existirá un clima de cosmopolitismo, sumamente favorable a la prosperidad del arte de la pintura. En 1496 había llegado a la capital andaluza, viniendo de Córdoba, un pintor que en aquella ciudad había casado, y que acaso había adoptado el apellido de su mujer, porque a pesar de llamarse Alejo Fernández, se le denomina a veces como «pintor alemán». Es un pintor de gran talento, uno de esos artistas que por los años de la primera mitad del siglo XVI aparecen con flamenquismos e italianismos a la vez. Sus Vírgenes: la de los Navegantes (Capilla de la Casa de Contratación de Sevilla), la de la Rosa (iglesia de Santa Ana), la que pintó para la capilla de Maese Rodrigo, también en Sevilla, son versiones distintas, pero todas ellas de un estilo refinadísimo, del tema de la Madre de Dios. Su italianismo aparece más claro en el Tríptico de la Cena, del Pilar de Zaragoza.
La importancia comercial de Sevilla atrajo sin duda a otro extranjero en 1537. Fue el bruselense Pedro de Campaña (o Kempeneer). Se lo encuentra en Sevilla en 1537, pintando para la catedral; pero antes había residido en Bolonia. Tras sus años sevillanos regresaría en 1563 a su patria. La característica que mejor define el estilo que impera en su obra es que se trataba de un pintor de claro temperamento dramático. Lo revelan sus dos famosas Crucifixiones, una en Bruselas y la otra que se halla conservada en la sacristía de la catedral sevillana.
En otras pinturas que dejó en Sevilla (como, por ejemplo, el retablo mayor de la iglesia de Santa Ana, pintado en 1557), muestra también otras calidades dignas de reseñar, sobre todo de iluminación y tierno realismo, que serán, por otro lado, típicas de la escuela pictórica de Sevilla durante la centuria posterior.
Otro gran pintor italianizante de la escuela sevillana del XVI es Luís de Vargas, al que Pacheco en su Libro de Retratos llamará «luz de la Pintura y padre dignísimo della en esta patria suya Sevilla». Nació, hijo de pintor, en 1566, y a los veintiún años se hallaba en Roma, en donde hubo de presenciar el saqueo de la ciudad por las tropas de Carlos V. No regresó definitivamente a su patria hasta el año 1553, y murió en 1568.
Según Pacheco es probable que hubiese sido discípulo de Pierin del Vaga, que a su vez lo fue de Rafael. En Andalucía, la catedral de Sevilla conserva de él dos obras muy famosas: una de ellas es el retablo del Nacimiento, fechado en 1555; la otra es el retablo titulado Generación temporal de Cristo, del año 1561, obra que a causa de la pierna (pintada en escorzo) del Adán, que figura en su tabla central, es universalmente conocida bajo la denominación de La Gamba. Es una movida composición de gran suavidad de formas, inspirada, a lo que parece, en una pintura de Vasari.
Gran importancia reviste la pintura española de retrato durante la época que se examina. Carlos V se valió para esto del Tiziano, quien jamás se movió de Italia, y bajo Felipe II el retratista real fue, al principio, el neerlandés Antonio Moro, que sí estuvo en la Península y en Lisboa. De él había de aprender directamente Sánchez Coello.
Alonso Sánchez Coello nació en 1531 en el pueblecito de Benifayó, en el reino de Valencia. Se ha barajado la hipótesis de que seguramente su ascendencia materna fuese portuguesa; el caso es que sí que está demostrado que cuando tenía diez años se trasladó con sus padres a Portugal, donde se hallaba establecido su abuelo al servicio del rey don Juan III. Sus contactos con Antonio Moro posiblemente empezaron en 1550; y es seguro que se trasladó a Mandes, pero en 1555 trabajaba ya para la corte de Castilla, en Vallado-lid, y pasó después a Toledo, y finalmente a Madrid, siendo ya «pintor de cámara» del rey. Si como retratista aprendió de Moro, ejerció en él gran influencia el arte del Tiziano, algunas de cuyas obras consta que copió.
Catalina Micaela de Austria de Sánchez Coello (Museo del Prado, Madrid). Forma parte de la interminable serie que dedicó a los hijos de Felipe II. Sus retratos cortesanos eran imitados en toda Europa, a la vez que se imitaban con ellos las costumbres españolas. El espacio viene indicado por algún accesorio, ya sea una silla o una cortina. Con su minuciosidad linearista, Coello capta la psicología del personaje en la actitud, en la expresión de los ojos, en el mohín de la boca, en la posición de las manos.